高速離心技術在生物學上應用

前言：離心技術在生物科學，特別是在生物化學和分子生物學研究領域，已得到十分廣泛的應用，每個生物化學和分子生物學實驗室都要裝備多種型式的離心機。離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。
基本的工作原理
當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：
F = m•a = m•ω2 r
a — 粒子旋轉的加速度， m — 沉降粒子的有效質量，ω—粒子旋轉的角速度， r—粒子的旋轉半徑 cm 。
通常離心力常用地球引力的倍數來表示，因而稱為相對離心力 “ RCF ”。或者用數字乘“g”來表示，例如25000×g，則表示相對離心力為25000。相對離心力是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數，單位是重力加速度“g”
（980cm/sec2），此時“RCF”相對離心力可用下式計算：
∴ RCF = 1.119×10－5×rpm2 r
rpm — revolutions per minute每分鐘轉數，r/min
由上式可見，只要給出旋轉半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。但是由于轉頭的形狀及結構的差異，使每臺離心機的離心管，從管口至管底的各點與旋轉軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規定旋轉半徑均用平均半徑“ra v”代替：
ra v= r min＋rmax / 2
r的測量如下圖所示：
34º
rmin
旋轉軸 rav
rmax
一般情況下，低速離心時常以轉速“rpm”來表示，高速離心時則以“g” 表示。計算顆粒的相對離心力時，應注意離心管與旋轉軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報告超離心條件時，通常總是用地心引力的倍數“×g”代替每分鐘轉數“rpm”，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內不同位置的離心力及其動態變化?？萍嘉墨I中離心力的數據通常是指其平均值（RCFa v），即離心管中點的離心力。
為便于進行轉速和相對離心力之間的換算，Dole 和Cotzias 利用RCF的計算公式，制作了轉速“rpm”、相對離心力“RCF”和旋轉半徑“r”三者關系的列線圖，圖式法比公式計算法方便（列線圖參見附錄）。換算時，先在r標尺上取已知的半徑和在rpm標尺上取已知的離心機轉數，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標尺上的交叉點即為相應的相對離心力數值。注意，若已知的轉數值處于rpm標尺的右邊，則應讀取RCF標尺右邊的數值，轉數值處于rpm標尺左邊，則應讀取RCF標尺左邊的數值。

離心機的主要構造和類型
離心機可分為工業用離心機和實驗用離心機。實驗用離心機又分為制備性離心機和分析性離心機，制備性離心機主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機一般都帶有光學系統，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質，依據待測物質在離心場中的行為（用離心機中的光學系統連續監測），能推斷物質的純度、形狀和分子量等。分析性離心機都是超速離心機。
1. 制備性離心機可分為三類：
⑴ 普通離心機：zui大轉速6000 rpm左右，zui大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉子有角式和外擺式，其轉速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質，如紅血球、酵母細胞等。這種離心機多用交流整流子電動機驅動，電機的碳刷易磨損，轉速是用電壓調壓器調節，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉頭是置于一個硬質鋼軸上，因此地平衡離心管及內容物就極為重要，否則會損壞離心機。
⑵ 高速冷凍離心機：zui大轉速為20000～25000rpm（r/min），zui大相對離心力為89000×g，zui大容量可達3升，分離形式也是固液沉降分離，轉頭配有各種角式轉頭、蕩平式轉頭、區帶轉頭、垂直轉頭和大容量連續流動式轉頭、一般都有制冷系統，以消除高速旋轉轉頭與空氣之間摩擦而產生的熱量，離心室的溫度可以調節和維持在0～40C，轉速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有指針或數字顯示，通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器如核蛋白體或單個分子。
⑶ 超速離心機：轉速可達50000～80000 rpm，相對離心力zui大可達510000×g，zui的生產廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機的出現，使生物科學的研究領域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質和多糖等。
超速離心機主要由驅動和速度控制、溫度控制、真空系統和轉頭四部分組成。超速離心機的驅動裝置是由水冷或風冷電動機通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應電機驅動，并由微機進行控制，由于驅動軸的直徑較細，因而在旋轉時此細軸可有一定的彈性彎曲，以適應轉頭輕度的不平衡，而不致于引起震動或轉軸損傷，除速度控制系統外，還有一個過速保護系統，以防止轉速超過轉頭zui大規定轉速而引起轉頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制是由安裝在轉頭下面的紅外線射量感受器直接并連續監測離心腔的溫度，以保證更準確更靈敏的溫度調控，這種紅外線溫控比高速離心機的熱電偶控制裝置更敏感，更準確。
超速離心機裝有真空系統，這是它與高速離心機的主要區別。離心機的速度在2000 rpm以下時，空氣與旋轉轉頭之間的磨擦只產生少量的熱，速度超過20000 rpm時，由磨擦產生的熱量顯著增大，當速度在40000 rpm以上時，由磨擦產生的熱量就成為嚴重問題，為此，將離心腔密封，并由機械泵和擴散泵串聯工作的真空泵系統抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達到所需的超高轉速。
2. 轉頭：
⑴ 角式轉頭：角式轉頭是指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4～12個裝離心管用的機制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉軸之間的角度在20～40度之間，角度越大沉降越結實，分離效果越好。這種轉頭的優點是具有較大的容量，且重心低，運轉平衡，壽命較長，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側就會出現顆粒沉積，此現象稱為“壁效應”，壁效應容易使沉降顆粒受突然變速所產生的對流擾亂，影響分離效果。
⑵ 蕩平式轉頭：這種轉頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構成。當轉頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉頭轉速達到每分鐘200到800轉時，吊桶蕩至水平位置，這種轉頭做密度梯度區帶離心，其優點是梯度物質可放在保持垂直的離心管中，離心時被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結束后由管內分層取出已分離的各樣品帶。其缺點是顆粒沉降距離長，離心所需時間也長。

⑶ 區帶轉頭：區帶轉頭無離心管，主要由一個轉子桶和可旋開的頂蓋組成，轉子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內分隔成四個或多個扇形小室，隔板內有導管，梯度液或樣品液從轉頭中央的進液管泵入，通過這些導管分布到轉子四周，轉頭內的隔板可保持樣品帶和梯度介質的穩定。沉降的樣品顆粒在區帶轉頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區帶轉頭的“壁效應”極小，可以避免區帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優點，使超離心用于制備和工業生產成為可能。區帶轉頭的缺點是樣品和介質直接接觸轉頭，耐腐蝕要求高，操作復雜。
⑷ 垂直轉頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離zui短，離心所需時間也短，適合用于密度梯度區帶離心，離心結束后液面和樣品區帶要作九十度轉向，因而降速要慢。

⑸ 連續流動轉頭：可用于大量培養液或提取液的濃縮與分離，轉頭與區帶轉頭類似，由轉子桶和有入口和出口的轉頭蓋及附屬裝置組成，離心時樣品液由入口連續流入轉頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉子桶壁，上清液由出口流出。
3. 離心管：
離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。
不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。
塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：
①防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。②防止樣
品揮發。③支持離心管，防止離心管變形。
4. 分析性離心機：
分析性離心機使用了特殊設計的轉頭和光學檢測系統，以便連續地監視物質在一個離心場中的沉降過程。從而確定其物理性質。
分析性超速離心機的轉頭是橢圓形的，以避免應力集中于孔處。此轉頭通過一個有柔性的軸聯接到一個高速的驅動裝置上，轉頭在一個冷凍的和真空的腔中旋轉，轉頭上有2～6個裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機中裝有一個光學系統，在整個離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監測離心杯中沉降著的物質，在預定的期間可以拍攝沉降物質的照片，在分析離心杯中物質沉降情況時，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結果在檢測系統的照像底板上產生了一個“峰”，由于沉降不斷進行，界面向前推進，因此峰也移動，從峰移動的速度可以計算出樣品顆粒的沉降速度。
分析性超速離心機和主要特點就是能在短時間內，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計算生物大分子的沉降系數，結合界面擴散，估計分子的大小，檢測分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測定生物大分子的分子量，還可以檢測生物大分子的構象變化等。

制備性超速離心的分離方法：
1. 差速沉降離心法：
這是zui普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒。
差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內進行離心時，在離心管底部就會得到zui大和zui重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。
2. 密度梯度區帶離心法（簡稱區帶離心法）：
區帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。此法的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。
此法的缺點是：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質溶液；③操作嚴格，不易掌握。
密度梯度區帶離心法又可分為兩種：
（1）差速區帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質的不同區域上形成區帶的方法稱為差速區帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數差的顆粒（20% 的沉降系數差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質，與顆粒的密度無關，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質溶液，樣品液加在梯度介質的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，zui后形成一系列界面清楚的不連續區帶，沉降系數越大，往下沉降越快，所呈現的區帶也越低，離心必須在沉降zui快的大顆粒到達管底前結束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質的密度。梯度介質通常用蔗糖溶液，其zui大密度和濃度可達1.28 kg/cm3和60％。
此離心法的關鍵是選擇合適的離心轉速和時間
（2）等密度區帶離心法：離心管中預先放置好梯度介質，樣品加在梯度液面上，或樣品預先與梯度介質溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預形成梯度和離心形成梯度的等密度區帶離心產生梯度的二種方式。
離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區帶，這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態后，再延長離心時間和提高轉速已無意義，處于等密度點上的樣品顆粒的區帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉速可以縮短達到平衡的時間，離心所需時間以zui小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數日。
等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關，但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區帶寬度。
等密度區帶離心法所用的梯度介質通常為氯化絕CSCl，其密度可達1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質，但簡單蛋白質不適用。
收集區帶的方法有許多種，例如：
（1） 用注射器和滴管由離心管上部吸出。
（2） 有針刺穿離心管底部滴出。
（3） 用針刺穿離心管區帶部份的管壁，把樣品區帶抽出。
（4）用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質zui大密度的取代液，將樣品和梯度介質壓出，用自動部分收集器收集。

離心操作的注意事項
高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設備，因其轉速高，產生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養，都可能發生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規程。
1. 使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規定的范圍，每個離心機不同的轉頭有各自的允許差值，轉頭中不能裝載單數的管子，當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。
2. 裝載溶液時，要根據各種離心機的具體操作說明進行，根據待離心液體的性質及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉頭，及時清洗、擦干，轉頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。
4. 離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。
5. 每個轉頭各有其zui高允許轉速和使用累積*，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉頭的zui高使用*，則須按規定降速使用。